一、概述
M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶是從莫洛尼鼠的白血病病毒中獲得的，M-MLV是將病毒中的反轉(zhuǎn)錄酶進行遺傳性上的整改，除去它的核糖核酸酶H活性后形成的一種反轉(zhuǎn)錄酶，在使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶進行RT時需要Mg或Mn離子作為輔助因子。
逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)從MoloneyMurineLeukemiaVirus分離出來，可用于合成**鏈cDNA、制作cDNA探針、RNA轉(zhuǎn)錄、測序和RNA的逆轉(zhuǎn)錄反應。本酶是通過點突變使RNaseH活性缺失，所以它具有的dna聚合酶的活性與野生型相同，同時其延伸能力也有顯著提高。
逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)一個活性單位定義為在37℃，10min條件下，使1nmol的脫氧核糖核酸摻入酸性沉淀物質(zhì)所需的酶量。
二、組份
Cat KGEM01(4000units) KGEM02(10000units) KGEM03(20000units)
逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV) 20μL 50μL 100μL
10×M-MLVReactionBuffer 50μL 150μL 300μL
DTT 30μL 80μL 150μL
三、合成**鏈cDNA的步驟
以下試劑客戶自己提供
dNTPs(10mM)
隨機引物(oligodT(18)或隨機引物或特異性引物;引物選擇請參考下頁“注意事項”)
無核酸酶雙蒸水
RNA模板
RNase抑制劑
RT反應(20μL體系)：
1、使用前每個組份輕輕混勻，然后2000rpm離心20s;
2、取滅過菌且無核酸酶的0.2ml離心管，依次加入
2～5μgRNAnμL
引物﹡1μL
【引物﹡：OligodT(18(10μM)或隨機引物(50ng/μL)或特異性引物(2μM)】
dNTPs(10mM)1μL
補加無核酸酶的雙蒸水至總體積15.5μL
3、65℃保溫5min，然后冰浴5min;
4、往3步驟中的0.2ml離心管依次加入下列組份
RNase抑制劑(40u/μL)0.5μL
10×M-MLVReactionBuffer2μL
DTT(200mM)1μL
逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)1μL
5、輕輕混勻后，然后2000rpm離心20s;
6、先在37℃保溫1hr，然后70℃保溫15min;
7、上述產(chǎn)物可立即進行下一步的PCR反應或-20℃保存。
四、注意事項
在進行RT反應之前，應考慮以下幾個方面：
1、RNA
成功的cDNA合成來自高質(zhì)量的RNA，高質(zhì)量的RNA至少應保證全長并且不含逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制劑，如EDTA或SDS。在提取RNA的過程中，要特別防止RNase的污染，同時在逆轉(zhuǎn)錄反應中經(jīng)常加入RNase抑制劑以增加cDNA合成的長度和產(chǎn)量。RNase抑制劑要在**鏈cDNA合成反應中，在緩沖液和還原劑(如DTT)存在的條件下加入，因為cDNA合成前的過程會使抑制劑變性，從而釋放結合的可以降解RNA的RNase。蛋白RNase抑制劑僅防止RNaseA，B，C對RNA的降解，并不能防止皮膚上的RNase，因此盡管使用了這些抑制劑，也要小心不要從手指上引入RNase，實驗過程中經(jīng)常更換新手套。
2、引物的選擇
OligodT
選擇OligodT時，要求RNA必須有PolyA，所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT，所以對RNA樣品的質(zhì)量要求較高，好不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進行RT反應，建議推薦使用OligodT引物。使用OligodT引物要比隨機引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
隨機引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況(比如某個gene表達量很低)。選擇隨機引物時，**鏈cDNA合成反應中就是以所有的RNA為模板，然后進行PCR反應時設計引物進行特異性擴增。同時要注意隨機引物的量和總RNA量之間的關系，一般建議每5μg總RNA的隨機引物的用量為50ng，如果每5μg總RNA的隨機引物的用量超過250ng，可能會導致小片段產(chǎn)物(<500bp)的增加和長片斷、全長產(chǎn)物產(chǎn)物的降低。
特異性引物
特異性引物只能用你設計引物時的下游引物做RT，引物設計質(zhì)量影響RT的結果，而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以按照說明書按照一個溫度做不是佳選擇，一般不推薦。
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M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶與AMV反轉(zhuǎn)錄酶相比，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶缺乏連續(xù)性，因此若想使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶獲得較大量的cDNA就要使用比其他酶更多的量。M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶的活性能夠被亞精胺抑制，因此在使用時不能用含有亞精胺的緩沖液。
